Коли ендонуклеаза рестрикції розпізнає послідовність, вона прорізає молекулу ДНК шляхом каталізує гідроліз зв'язку між сусідніми нуклеотидами.
Ферменти рестрикції також називаються «молекулярними ножицями». розщеплюють ДНК на або поблизу специфічних послідовностей розпізнавання, відомих як сайти рестрикції. Ці ферменти роблять по одному розрізу на кожному з двох ланцюгів ДНК і також називаються ендонуклеазами рестрикції.
Ендонуклеази рестрикції розпізнавати певні послідовності в ДНК і розрізати ДНК на фрагменти. Специфічні сайти мають довжину 4-6 bp і називаються сайтами рестрикції. Кожна ендонуклеаза рестрикції має певний сайт рестрикції.
EcoRI є рестриктазою типу II, яка розрізає ДНК спеціально в місці рестрикції, утворюючи липкі кінці. Це робить реакцію лігування більш ефективною.
Ферменти рестрикції є ферментами, що розрізають ДНК. Кожен фермент розпізнає одну або кілька цільових послідовностей і розрізає ДНК на цих послідовностях або поблизу них. Багато рестриктаз роблять розрізи в шаховому порядку, утворюючи кінці з одноланцюговими виступами ДНК.
Ендонуклеази рестрикції розпізнавати конкретні послідовності ДНК, сайти їх розпізнавання та розщеплювати ДНК, що несе цільові послідовності, за умови, що ці сайти не були модифіковані метилюванням специфічних основ у послідовності.